Technologieplattform Kryo-Elektronenmikroskopie
Die von der Universität Hamburg betriebene Multi-User-Kryo-EM-Technologieplattform befindet sich im „Centre for Structural Systems Biology (CSSB)“ auf dem Wissenschaftscampus Bahrenfeld, Hamburg, Deutschland. Wir unterstützen eine Vielzahl von strukturbiologischen Projekten, die das Ziel haben Wirt-Pathogen-Interaktionen auf molekularer und zellulärer Ebene zu verstehen.
Schwerpunkte
Unsere Einrichtung legt den Schwerpunkt auf die Kryo-EM-Modalitäten „Einzelpartikelanalyse“ (SPA) und „Kryo-Elektronentomographie“ (Kryo-ET). Die nutzerfreundliche Anwendung der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (cryo-CLEM) wird durch unsere enge Zusammenarbeit mit der Core Facility „Advanced Light and Fluorescence Microscopy“ (ALFM) am CSSB entwickelt.
Wenn Sie sich für die Nutzung der Kryo-Elektronenmikroskopie-Technologieplattform interessieren, kontaktieren Sie uns gern unter cryoem"AT"cssb-hamburg.de. Wir helfen Ihnen gerne weiter!
Inhalt
Angebot der Kryo-Elektronenmikroskopie
Wir ermöglichen Forschenden, die Kryo-EM in ihrem eigenen Forschungsportfolio nutzen möchten, unabhängig in unserer Einrichtung zu arbeiten. Dafür haben wir praktische und theoretische Kurse für die Datenaufnahme und Datenanalyse auf verschiedenen Niveaus erarbeitet. Wir unterstützen zudem Technologieprojekte, die Synergien zwischen der Kryo-Elektronenmikroskopie-Plattform und dem Wissenschaftscampus Bahrenfeld schaffen und durch Drittmittel finanziert werden.
Welche Proben können analysiert werden?
Die Kryo-Elektronenmikroskopie-Plattform konzentriert sich auf die Analyse von Proben im Bereich der Infektionsbiologie, insbesondere auf Wirt-Pathogen-Interaktionen. Dabei können verschiedene Proben analysiert werden, darunter aufgereinigte, biologische Makromoleküle und Komplexe, Pathogenen und infizierte Zellen.
Kontakt zum Team und Zugang zu den Geräten
Unser Team der Technologieplattform Kryo-Elektronenmikroskopie freut sich, Forschenden die Möglichkeiten zu bieten, durch den Einsatz von Kryo-Elektronenmikroskopie einen wertvollen Beitrag zu ihren Forschungsprojekten zu leisten. Wir unterstützen Sie gerne bei der Planung und Durchführung von Experimenten und bei der Datenanalyse.
Bei Fragen wenden Sie sich bitte an cryoem"AT"cssb-hamburg.de.
Standort der Geräte
Multi-User-Cryo-EM Facility
Technologieplattform
Centre for Structural Systems Biology (CSSB)
c/o DESY, Gebäude 15,
Notkestr. 85
22607 Hamburg
Deutschland
Wer kann die Geräte der Cryo-EM nutzen?
Unsere Einrichtung steht im Wesentlichen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen folgender akademischer Forschungseinrichtungen offen, die sich die Betriebskosten der Kryo-EM Technologieplattform teilen:
- Universität Hamburg
- Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin
- Deutschen Elektronen-Synchrotron DESY
- European Molecular Biology Laboratory
- Forschungszentrum Borstel – Leibniz Lungenzentrum
- Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH
- Leibniz-Institut für Virologie
- Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Die Technologieplattform für Kryo-EM nimmt darüber hinaus weitere Anfragen für Forschung zu den in der Einrichtung verwendeten Methoden oder Geräten von externen wissenschaftlichen Einrichtungen entgegen. Die Einrichtung steht für industrielle, kommerzielle Serienmessungen oder Schulungen nicht zur Verfügung. Die gemeinsame Datenerfassung von vorab mikroskopisch analysierten vitrifizierten Proben unter Beteiligung von Mitarbeitenden der Einrichtung kann von Fall zu Fall vereinbart werden.
Für weitere Informationen besuchen Sie bitte die Website der Technologieplattform Kryo-Elektronenmikroskopie am CSSB oder kontaktieren Sie:
Dr. Carolin Seuring
Koordinatorin
Telefon: +49 040 8998 87707
E-Mail: carolin.seuring"AT"cssb-hamburg.de
Wie erfolgt die Einweisung an den Geräten?
Der Zugang zu den Räumlichkeiten der Technologieplattform muss durch eine entsprechende Sicherheitsschulung genehmigt werden. Besucher:innen des Hauptlaborbereichs müssen zu jeder Zeit unter der Aufsicht einer Mitarbeiterin oder eines Mitarbeiters von cryo-EM oder einer autorisierten Benutzerin bzw. eines authorisierten Benutzers stehen.
Um eine Buchung für eine Schulung anzufragen, senden Sie bitte eine E-Mail mit den unten stehenden Informationen an cryoem"AT"cssb-hamburg.de:
- Name, Gruppe, Affiliierung
- Projekttyp, beabsichtigte Dauer des geplanten Projekts, Vordaten
- Art der geplanten Nutzung: unabhängige Nutzung, Kollaboration mit einer CSSB Gruppe, Trainingsmodul
- Erfahrungsstand in Kryo-EM
- Art der Proben und Informationen zur biologischen Sicherheitsstufe
Welche Schulungsmodule werden angeboten?
Mikroskop-Schulungen
- Talos L120: Schulung zur sicheren Verwendung und praktischen Anwendung des Talos L120 für die Untersuchung von Negative-Stain-Proben
- Talos Arctica mit Falcon IV: Schulung zur Verwendung des Talos Arctica für die Untersuchung von vitrifizierten Proben
- Titan Krios: Schulung zur Verwendung des Titan Krios für die hochauflösende Datenaufnahme von vitrifizierten Proben unter Nutzung eines Energiefilters und K3-Detektor
- Tomographie: Schulung zur Tomographie-Datenaufnahme mit der Thermo Fisher Tomographie Software und/oder SerialEM an den Krios-Mikroskopen
- Aquilos FIB-SEM: Schulung zur Präparation von vitrifizierten Lamellen für Kryo-Anwendungen
- Arctis Kryo-Plasma FIB-SEM: Schulung zur automatisierten Präparation von vitrifizierten Lamellen für Kryo-Anwendungen
Probenpräparation
- Negative-Stain-Probenpräparation zur Vorbereitung von Proben für die Elektronenmikroskopie mit Uranylacetat
- Erlernen der Präparation von Kohlenstoffbeschichtungen mit Hilfe des Leica ACE600, einschließlich praktischer Anwendung und Erstellung von Rezepten
- Vitrobot-Einweisung zur für die Kryo-Probenpräparation, einschließlich Theorie und praktischer Anwendung
- Manuelles Einfrieren zur für die Kryo-Probenpräparation, einschließlich Theorie und praktischer Anwendung
- Leica GP2 Einfrieren zur für die Kryo-Probenpräparation, einschließlich Theorie und praktischer Anwendung
- Chameleon Einweisung: Einfrieren zur für die Kryo-Probenpräparation, einschließlich Theorie und praktischer Anwendung
- Leica EM ICE Einweisung zur Präparation von “Waffel”-Netzchen, einschließlich Theorie und praktischer Anwendung (durch die Core Facility ALFM)
- Schulung zur Vorbereitung von Kryo-EM Autogrids
Wie kann ich Geräte buchen?
Nutzende können über das PPMS-Buchungssystem Instrumente buchen, sobald sie die Schulung abgeschlossen haben. Der Zugang zum Buchungssystem wird nach einem Training und dem Unterzeichnen der Nutzungsordnung eingerichtet. Weitere Informationen finden Sie auf der Webseite des CSSB.
Kurse und Workshops
10. bis 21. Februar 2025
Grundprinzipien und praktische Aspekte der CryoEM-SPA und Tomographie (Modul 62-485.1)
Projekte und Vorlesungen
Laufende drittmittelfinanzierte Projekte
Die Kryo-EM Technologieplattform ist offen für Kooperationsprojekte mit Forschenden mit besonderem Fokus auf Methodenentwicklung für die Kryo-Elektronenmikroskopie.
- CUI:AIM Projekt „Jetfreezing – Novel Sample Delivery Approaches for CryoEM“
Kooperationspartner: Bajt, Chapman, Grünewald, Küpper - CSSB Flagship Project „Plasmofraction“
Kooperationspartner: Filarski, Kosinski, Löw, Witt, Seuring - CUI:AIM Projekt „Cd/Te lambda-Detector“
Kooperationspartner: X-Spectrum, Grünewald, Pearson, Chapman
Relevante Vorlesungen an der Universität Hamburg
- 62-169.12, Bioimaging methods seminar series, weekly (1.5 ECTS)
- 62-417.1, Strukturbiochemie, Summer Semester (3.0 ECTS)
- 62-417.3, Praktikum Strukturbiochemie mit Begleitseminar, Summer Semester (4.5 ECTS)
- 62-485.1, Basic Principles and practical aspects of CryoEM, 04.09.–15.09.2023 (3.0 ECTS)
- 62-485.2, Hands-on practice on specimen preparation, and data acquisition, 04.09.–15.09.2023 (3.0 ECTS)
Publikationen
2023
Ferreira JL, Prazak V, Vasishtan D, Siggel M, Hentzschel F, Binder AM, Pietsch E, Kosinski J, Frischknecht F, Gilberger TW, Grunewald K (2023) Variable microtubule architecture in the malaria parasite. Nat Commun 14: 1216 doi: 10.1038/s41467-023-36627-5
Seyfert CE, Porten C, Yuan B, Deckarm S, Panter F, Bader CD, Coetzee J, Deschner F, Tehrani KHME, Higgins PG, Seifert H, Marlovits TC, Herrmann J, Muller R (2023) Darobactins Exhibiting Superior Antibiotic Activity by Cryo-EM Structure Guided Biosynthetic Engineering. Angew Chem Int Edit 6210.1002/anie.202214094
Williams HM, Thorkelsson SR, Vogel D, Milewski M, Busch C, Cusack S, Grunewald K, Quemin ERJ, Rosenthal M (2023) Structural insights into viral genome replication by the severe fever with thrombocytopenia syndrome virus L protein. Nucleic Acids Research 51: 1424-1442 doi: 10.1093/nar/gkac1249
2022
Bucker R, Seuring C, Cazey C, Veith K, Garcia-Alai M, Grunewald K, Landau M (2022) The Cryo-EM structures of two amphibian antimicrobial cross-beta amyloid fibrils. Nature Communications 13ARTN 4356 10.1038/s41467-022-32039-z
Franken LE, Rosch R, Laugks U, Grunewald K (2022) Protocol for live-cell fluorescence-guided cryoFIB-milling and electron cryo-tomography of virus-infected cells. STAR Protoc 3: 101696 doi: 10.1016/j.xpro.2022.101696
Killer M, Finocchio G, Mertens HDT, Svergun DI, Pardon E, Steyaert J, Loew C (2022) Cryo-EM Structure of an Atypical Proton-Coupled Peptide Transporter: Di- and Tripeptide Permease C. Front Mol Biosci 9ARTN 917725 10.3389/fmolb.2022.917725
Niebling S, Veith K, Vollmer B, Lizarrondo J, Burastero O, Schiller J, Garcia AS, Lewe P, Seuring C, Witt S, Garcia-Alai M (2022) Biophysical Screening Pipeline for Cryo-EM Grid Preparation of Membrane Proteins. Front Mol Biosci 9ARTN 882288 10.3389/fmolb.2022.882288
Pazicky S, Alder A, Mertens H, Svergun DI, Gilberger T, Low C (2022) N-terminal phosphorylation regulates the activity of Glycogen Synthase Kinase 3 from Plasmodium falciparum. Biochem J 10.1042/BCJ20210829
Villalta A, Schmitt A, Estrozi LF, Quemin ER, Alempic JM, Lartigue A, Prazak V, Belmudes L, Vasishtanm D, Colmant AM, Honore FA, Coute Y, Grunewald K, Abergel C (2022) The giant mimivirus 1.2 Mb genome is elegantly organized into a 30-nm diameter helical protein shield. Elife 11ARTN e77607 10.7554/eLife.77607
Wald J, Fahrenkamp D, Goessweiner-Mohr N, Lugmayr W, Ciccarelli L, Vesper O, Marlovits TC (2022) Mechanism of AAA plus ATPase-mediated RuvAB-Holliday junction branch migration. Nature 609: 630-+ doi: 10.1038/s41586-022-05121-1
2021
Albers S, Beckert B, Matthies MC, Mandava CS, Schuster R, Seuring C, Riedner M, Sanyal S, Torda AE, Wilson DN, Ignatova Z (2021) Repurposing tRNAs for nonsense suppression. Nature Communications 1210.1038/s41467-021-24076-x
Ayyer K, Xavier PL, Bielecki J, Shen Z, Daurer BJ, Samanta AK, Awel S, Bean R, Barty A, Bergemann M, Ekeberg T, Estillore AD, Fangohr H, Giewekemeyer K, Hunter MS, Karnevskiy M, Kirian RA, Kirkwood H, Kim Y, Koliyadu J, Lange H, Letrun R, Lubke J, Michelat T, Morgan AJ, Roth N, Sato T, Sikorski M, Schulz F, Spence JCH, Vagovic P, Wollweber T, Worbs L, Yefanov O, Zhuang YL, Maia FRNC, Horke DA, Kupper J, Loh ND, Mancuso AP, Chapman HN (2021) 3D diffractive imaging of nanoparticle ensembles using an x-ray laser. Optica 8: 15-23 doi: 10.1364/Optica.410851
Bunduc CM, Fahrenkamp D, Wald J, Ummels R, Bitter W, Houben ENG, Marlovits TC (2021) Structure and dynamics of a mycobacterial type VII secretion system. Nature 593: 445-448 doi: 10.1038/s41586-021-03517-z
Killer M, Wald J, Pieprzyk J, Marlovits TC, Low C (2021) Structural snapshots of human PepT1 and PepT2 reveal mechanistic insights into substrate and drug transport across epithelial membranes. Sci Adv 7: eabk3259 doi: 10.1126/sciadv.abk3259
Kotov V, Lunelli M, Wald J, Kolbe M, Marlovits TC (2021) Helical reconstruction of Salmonella and Shigella needle filaments attached to type 3 basal bodies. Biochem Biophys Rep 27: 101039 doi: 10.1016/j.bbrep.2021.101039
Kotov V, Mlynek G, Vesper O, Pletzer M, Wald J, Teixeira-Duarte CM, Celia H, Garcia-Alai M, Nussberger S, Buchanan SK, Morais-Cabral JH, Loew C, Djinovic-Carugo K, Marlovits TC (2021) In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with MoltenProt. Protein Sci 30: 201-217 doi: 10.1002/pro.3986
Kouba T, Vogel D, Thorkelsson SR, Quemin ERJ, Williams HM, Milewski M, Busch C, Gunther S, Grunewald K, Rosenthal M, Cusack S (2021) Conformational changes in Lassa virus L protein associated with promoter binding and RNA synthesis activity. Nat Commun 12: 7018 doi: 10.1038/s41467-021-27305-5
Miletic S, Fahrenkamp D, Goessweiner-Mohr N, Wald J, Pantel M, Vesper O, Kotov V, Marlovits TC (2021) Substrate-engaged type III secretion system structures reveal gating mechanism for unfolded protein translocation. Nat Commun 12: 1546 doi: 10.1038/s41467-021-21143-1
Pfitzner S, Bosse JB, Hofmann-Sieber H, Flomm F, Reimer R, Dobner T, Gruenewald K, Franken LE (2021) Human Adenovirus Type 5 Infection Leads to Nuclear Envelope Destabilization and Membrane Permeability Independently of Adenovirus Death Protein. International Journal of Molecular Sciences 22ARTN 13034 10.3390/ijms222313034
Prazak V, Grunewald K, Kaufmann R (2021) Correlative super-resolution fluorescence and electron cryo-microscopy based on cryo-SOFI. Methods Cell Biol 162: 253-271 doi: 10.1016/bs.mcb.2020.10.021
Silvester E, Vollmer B, Prazak V, Vasishtan D, Machala EA, Whittle C, Black S, Bath J, Turberfield AJ, Grunewald K, Baker LA (2021) DNA origami signposts for identifying proteins on cell membranes by electron cryotomography. Cell 184: 1110-1121 e1116 doi: 10.1016/j.cell.2021.01.033
Yuan B, Portaliou AG, Parakra R, Smit JH, Wald J, Li YC, Srinivasu B, Loos MS, Dhupar HS, Fahrenkamp D, Kalodimos CG, van Hoa FD, Cordes T, Karamanou S, Marlovits TC, Economou A (2021) Structural Dynamics of the Functional Nonameric Type III Translocase Export Gate. Journal of Molecular Biology 433ARTN 167188 10.1016/j.jmb.2021.167188
2020
Franken LE, Grunewald K, Boekema EJ, Stuart MCA (2020) A Technical Introduction to Transmission Electron Microscopy for Soft-Matter: Imaging, Possibilities, Choices, and Technical Developments. Small: e1906198 doi: 10.1002/smll.201906198
Lunelli M, Kamprad A, Burger J, Mielke T, Spahn CMT, Kolbe M (2020) Cryo-EM structure of the Shigella type III needle complex. PLoS Pathog 16: e1008263 doi: 10.1371/journal.ppat.1008263
Quemin ERJ, Machala EA, Vollmer B, Prazak V, Vasishtan D, Rosch R, Grange M, Franken LE, Baker LA, Grunewald K (2020) Cellular Electron Cryo-Tomography to Study Virus-Host Interactions. Annu Rev Virol 7: 239-262 doi: 10.1146/annurev-virology-021920-115935
Vogel D, Thorkelsson SR, Quemin ERJ, Meier K, Kouba T, Gogrefe N, Busch C, Reindl S, Gunther S, Cusack S, Grunewald K, Rosenthal M (2020) Structural and functional characterization of the severe fever with thrombocytopenia syndrome virus L protein. Nucleic Acids Res 48: 5749-5765 doi: 10.1093/nar/gkaa253
Vollmer B, Prazak V, Vasishtan D, Jefferys EE, Hernandez-Duran A, Vallbracht M, Klupp BG, Mettenleiter TC, Backovic M, Rey FA, Topf M, Grunewald K (2020) The prefusion structure of herpes simplex virus glycoprotein B. Sci Adv 610.1126/sciadv.abc1726
Wolff G, Limpens R, Zevenhoven-Dobbe JC, Laugks U, Zheng S, de Jong AWM, Koning RI, Agard DA, Grunewald K, Koster AJ, Snijder EJ, Barcena M (2020) A molecular pore spans the double membrane of the coronavirus replication organelle. Science 369: 1395-1398 doi: 10.1126/science.abd3629
2019
Moser, F., Prazak, V., Mordhorst, V., Andrade, D. M., Baker, L.A., Hagen, C., Grunewald, K., Kaufmann, R. (2019): Cryo-SOFI enabling low-dose super-resolution correlative light and electron cryo-microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 116: 4804-4809 doi: 10.1073/pnas.1810690116
Nikolaus Goessweiner-Mohr VK, Matthias J. Brunner, Julia Mayr, Jiri Wald, Lucas Kuhlen, Sean Miletic, Oliver Vesper, Wolfgang Lugmayr Samuel Wagner, Frank DiMaio, Susan Lea, Thomas C., Marlovits (2019) Structural control for the coordinated assembly into functional pathogenic type-3 secretion systems. BioArxiv https://doi.org/10.1101/714097
Geräteübersicht
Die Kryo-EM Technologieplattform bietet Zugang zu folgenden Mikroskopen, die alle über Fernzugriff bedient werden können:
Talos L120C
Thermo Fisher Scientific, mit 120 kV Beschleunigungsspannung und thermionische LaB6-Quelle
Es handelt sich um ein Screening-Mikroskop der Einstiegsklasse mit einer Ceta-Kamera, welches hauptsächlich für negativkontrastierte Proben, aber auch für Kryo-EM mit Seiteneintrittshalter genutzt wird. Dieses Mikroskop wird hauptsächlich für Schulungszwecke und die Bewertung der Probenpräparation in der Einzelpartikelanalyse verwendet. Das Mikroskop ist mit einem Lambda-Detektor der Firma X-Spektrum (DESY) für die Aufnahme von Beugungsdaten ausgestattet, was die Aufnahme von Beugungsdaten erlaubt. Zu den Softwareoptionen gehören SerialEM und Velox.
Talos Arctica
Thermo Fisher Scientific, mit 200 kV Beschleunigungsspannung und Feldemissionsquelle (X-FEG)
Es ist mit einem Autoloader, einem Falcon IVi Direktelektronendetektor und einer Phasenplatte ausgestattet. Dieses Mikroskop wird hauptsächlich für die Kryo-EM-Probenoptimierung und die Einzelpartikelanalyse eingesetzt. Zu den Softwareoptionen gehören gängige Thermo-Fisher-basierte Softwarelösungen und SerialEM.
Titan Krios G3
Thermo Fisher Scientific, mit 300 kV Beschleunigungsspannung und Feldemissionsquelle (X-FEG)
Spitzenmikroskop mit Autoloader, Bioquantum-Energiefilter, K3-Direktelektronendetektor, Phasenplatte, „Fringe-Free imaging“ und Zweiachsen-Probenhalter. Dieses Mikroskop wird für die Erfassung von Kryo-EM-Einzelpartikel- und Tomographiedaten verwendet. Zu den Softwareoptionen gehören Thermo-Fisher-basierte-Lösungen und SerialEM.
Titan Krios G3i
Thermo Fisher Scientific, 300 kV Beschleunigungsspannung und Feldemissionsquelle (X-FEG)
Spitzenmikroskop mit Autoloader, Bioquantum-Energiefilter, K3-Direktdetektor, Phasenplatte und „Fringe-Free imaging“. Dieses Mikroskop wird für die Erfassung von Kryo-EM-Einzelpartikel- und Tomographiedaten verwendet. Zu den Software-Optionen gehören TFS Software-Lösungen und SerialEM.
Aquilos 2 Cryo-FIB
Thermo Fisher Scientific
Ein Cryo-DualBeam-System mit fokussiertem Ionenstrahl und Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) für die Präparation von dünnen Lamellen von vitrifizierten Zellen für die anschließende Elektronen-Kryo-Tomographie. Ein integriertes Fluoreszenzlichtmikrsokop für korrelative Studien, und cryo-Liftout für die Präparierung dickerer Proben steht zur Verfügung. Diverse Thermo-Fisher-basierte-Software Lösungen stehen zur Verfügung
Arctis Cryo-Plasma FIB-SEM
Thermo Fisher Scientific
Das Arctis Cryo-Plasma System von ThermoFisher Scientific ist ein hochautomatisiertes Plasma FIB System (wahlweise mit Xenon-, Sauerstoff- oder Argon-Gasversorgung) und Rasterelektronenmikroskop. Ein integriertes Fluoreszenzlichtmikroskop erlaubt vereinfachtes Auffinden von Interessensgebieten, und ein automatisches Ladesystem für 12 Autogrids ermöglicht nahtlosen Transfer für die anschließende Elektronen-Kryo-Tomographie. Das Arctis wird gezielt für die Präparation von dünnen Lamellen von vitrifizierten Zellen oder dickeren Waffelproben eingesetzt. Die von Thermo Fisher speziell entwickelte Software-Lösung WebUI für vollständig automatisierte Lamellenbearbeitung, bietet eine Internet-basierte Lösung für externen Zugriff an. Die konventionellen Korrelations- und Ablationsprogramme Maps und AutoTEM stehen aber ebenfalls zur Verfügung.
Geräte für die Präparation von Proben und die Kultivierung von Säugetierzellen
Die Benutzenden haben weiterhin Zugang zu einer breiten Palette von Geräten für die Präparation von Proben und die Kultivierung von Säugetierzellen in BSL-1 und BSL-2 für letzte Präparationsschritte vor der Vitrifizierung. Dafür stehen zusätzliche Laborflächen zur Verfügung.